ขั้นตอนที่ 3: การปฏิสนธิในห้องปฏิบัติการ(Fertilization)

ขั้นตอนการเจาะเก็บไข่ (Ovum Pick-Up: OPU) และการเตรียมสเปิร์มถือเป็นหัวต่อสำคัญของการรักษาด้วยวิธี IVF/ICSI โดยเป็นกระบวนการที่นำเซลล์สืบพันธุ์ของทั้งฝ่ายหญิงและฝ่ายชายเข้ามาสู่ห้องปฏิบัติการเลี้ยงตัวอ่อน (Embryology Laboratory) ในวันเดียวกัน เพื่อเตรียมความพร้อมสำหรับการปฏิสนธิ

1. การเตรียมความพร้อมของไข่และอสุจิ (Preparation)

การลอกเซลล์บริวารรอบไข่ (Egg Denudation): ไข่ที่เก็บออกมาได้จะมีกลุ่มเซลล์บริวาร (Cumulus Cells) ห่อหุ้มอยู่หนาแน่น นักวิทยาศาสตร์จะใช้เอนไซม์อ่อนๆ ช่วยลอกเซลล์เหล่านี้ออก เพื่อส่องประเมินระยะความสมบูรณ์ของไข่แต่ละฟอง

การคัดเกรดความพร้อมของไข่:

• ไข่ระยะ MII (Metaphase II): ไข่ที่เจริญเติบโตสมบูรณ์เต็มที่ มีการสลัดขั้วเซลล์ (Polar Body) ออกมา ชัดเจนว่าเป็นไข่พร้อมปฏิสนธิ (มีเพียงไข่ระยะ MII เท่านั้นที่จะนำไปทำ ICSI)
• ไข่ระยะ MI หรือ GV: ไข่ดิบที่ยังเจริญเติบโตไม่เต็มที่ ยังไม่สามารถปฏิสนธิได้ในทันที
• การคัดเลือกอสุจิ (Sperm Selection): นำน้ำอสุจิมาคัดแยกเพื่อแยกอสุจิที่ตายแล้วและน้ำอสุจิออก คัดไว้เฉพาะตัวที่มีชีวิต รูปร่างสมบูรณ์ และว่ายตรงไปข้างหน้าได้ดีที่สุด

Oocyte (Cumulus-Oocyte Complex: COC) หลังจากเก็บไข่ OPU

Oocytes Metaphase II ไข่สุก ที่พร้อมปฏิสนธิ

Oocytes Metaphase I ไข่ที่ไม่สุก ยังไม่พร้อมที่ปฏิสนธิ

Oocytes Germinal vesicle ไข่ที่ไม่สุก ยังไม่พร้อมที่ปฏิสนธิ

2. เจาะลึกขั้นตอนการทำ ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection)

กระบวนการนี้ต้องอาศัยทักษะความชำนาญสูงของนักวิทยาศาสตร์เลี้ยงตัวอ่อน ร่วมกับเครื่องมือไมโครมานิพูเลเตอร์ (Micromanipulator) ที่มีความแม่นยำสูง:

• การจับยึดเซลล์ไข่: จัดไข่ระยะ MII ให้อยู่ในตำแหน่งที่เหมาะสมด้วยหลอดแก้วจับยึด (Holding Pipette)
• การคัดอสุจิเดี่ยว: ส่องดูอสุจิทีละตัว คัดเลือกตัวที่มีโครงสร้างหัว หาง และการเคลื่อนไหวสมบูรณ์ที่สุดเพียง 1 ตัว ต่อไข่ 1 ฟอง
• การฉีดอสุจิเข้าเนื้อไข่: ใช้เข็มแก้วฉีดอสุจิ (Injection Pipette) ที่มีขนาดเล็กกว่าเส้นผมมนุษย์ สะกิดหางอสุจิให้หยุดว่าย แล้วเจาะผ่านเปลือกไข่และเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อปล่อยอสุจิลงสู่เนื้อไข่ (Cytoplasm) โดยตรง กระบวนการนี้จะทำภายใน 4–6 ชั่วโมงหลังเก็บไข่เพื่อให้ได้ช่วงเวลาที่ไข่มีความพร้อมสูงสุด

3. การบ่มเพาะในตู้เลี้ยงตัวอ่อน (Incubation)

เมื่อทำ ICSI เรียบร้อย ไข่จะถูกย้ายลงในจานเพาะเลี้ยงที่มีสารอาหารเฉพาะ (Culture Media) แล้วนำเข้า ตู้บ่มเลี้ยงตัวอ่อน (Incubator) ที่ทำหน้าที่จำลองสภาพแวดล้อมให้ใกล้เคียงกับท่อนำไข่และมดลูกของแม่มากที่สุด:

• อุณหภูมิ: ควบคุมที่ 37.0°C
• สมดุลแก๊ส: ควบคุมระดับแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ (CO₂) และแก๊สออกซิเจน (O₂) เพื่อรักษาระดับความเป็นกรด-ด่าง (pH) ในอาหารเลี้ยงตัวอ่อนให้เหมาะสมที่สุด

4. การตรวจเช็กผลปฏิสนธิในวันที่ 1 (Day 1 Fertilization Check)

หลังจากฉีดอสุจิไปแล้วประมาณ 16–18 ชั่วโมง นักวิทยาศาสตร์จะส่องกล้องตรวจดูการปรากฏของ PN (Pronuclei) หรือนิวเคลียสของไข่และสเปิร์ม:

• 2PN (Normal Fertilization): ปรากฏวงนิวเคลียส 2 วงอย่างชัดเจน (1 วงจากแม่ + 1 วงจากพ่อ) หมายถึง ปฏิสนธิสมบูรณ์สำเร็จ ตัวอ่อนเริ่มรวมพันธุกรรมและพร้อมแบ่งเซลล์ต่อ
• 1PN / 3PN (Abnormal Fertilization): ปรากฏนิวเคลียสเพียงวงเดียว หรือมี 3 วงขึ้นไป ถือเป็นการปฏิสนธิที่ผิดปกติทางพันธุกรรม ตัวอ่อนกลุ่มนี้จะไม่สามารถนำไปย้ายกลับเข้าสู่มดลูกได้
• 0PN (Unfertilized): ไข่ไม่เกิดการปฏิสนธิ อสุจิไม่สามารถกระตุ้นให้ไข่ทำงานได้

ปัจจัยที่มีผลต่อความสำเร็จของการปฏิสนธิ

• คุณภาพของเนื้อไข่ (Egg Quality): ไข่ที่มีเนื้อไข่สมบูรณ์ โครงสร้างดี จะรับการกระตุ้นจากอสุจิได้ดีกว่าไข่ที่ฝ่ามหรือเปราะ
• ความสมบูรณ์ของ DNA สเปิร์ม: แม้สเปิร์มจะว่ายได้ดี แต่หากมีปัญหา DNA แตกหักสูง อาจส่งผลให้อัตราการปฏิสนธิลดลง
• มาตรฐานห้องปฏิบัติการและฝีมือนักวิทยาศาสตร์: ความแม่นยำในการวางตำแหน่งเจาะ ICSI การควบคุมอุณหภูมิ และความเสถียรของตู้บ่ม มีผลโดยตรงต่ออัตราการรอดชีวิตและการปฏิสนธิของไข่

เมื่อผ่านวันแรกและได้จำนวนตัวอ่อน 2PN ที่สมบูรณ์แล้ว ตัวอ่อนจะเริ่มแบ่งเซลล์จาก 2 เป็น 4 และ 8 เซลล์ เพื่อก้าวเข้าสู่ ขั้นตอนที่ 4: การเลี้ยงตัวอ่อนระยะบลาสโตซิสต์ (Blastocyst Culture) ในวันถัดไป